KOD DNA Polymerase(含超純dNTP) PCR相關(guān)
KOD DNA Polymerase 是從克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的質(zhì)粒在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)分離純化而來(lái)。該酶所具有的chao強(qiáng)3’→ 5’外切酶活性使得其保真性比Pfu DNA Polymerase 更高KOD DNA Polymerase(含超純dNTP) PCR相關(guān)
KOD DNA Polymerase (含超純 dNTP)
KOD DNA Polymerase(含超純dNTP) PCR相關(guān)
目錄號(hào):71516
產(chǎn)品內(nèi)容
產(chǎn)品成份 | 71516-250 | 71516-1000 |
KOD DNA Polymerase（5U/µl） | 250 U | 500 U |
10× KOD Buffer | 1 ml | 1 ml |
SuperPure dNTP mix（10 mM） | 0.1 ml | 0.2 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 2 年。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
KOD DNA Polymerase 是從克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的質(zhì)粒在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)分離純化而來(lái)。該酶所具有的chao強(qiáng)3’→ 5’外切酶活性使得其保真性比Pfu DNA Polymerase 更高，保真性是Taq DNA Polymerase的80倍，同時(shí)具有合成速度快的特點(diǎn)，聚合速度約為普通Pfu DNA Polymerase的5倍，Taq DNA Polymerase的2倍，達(dá)到100-138bp/秒，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高產(chǎn)量的擴(kuò)增產(chǎn)物，特別適合于高保真地?cái)U(kuò)增6kb以內(nèi)的PCR 產(chǎn)物，擴(kuò)增所得的DNA為平末端，可直接用于Blunt (平末端)載體克隆（Cat#V116、V117），也可用于基因克隆、表達(dá)及突變分析等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
活性單位:
KOD DNA Polymerase 活性定義為在 75°C 活性測(cè)定條件下，在 30 min內(nèi)攝入 10nmoles 的 dNTPs 使成為酸性不溶物時(shí)所需要酶的活性定義為1U。
質(zhì)量控制:
SDS-PAGE 檢測(cè)純度大于 99%，經(jīng)檢測(cè)無(wú)外源核酸酶活性；PCR 方法檢測(cè)無(wú)宿主殘余 DNA，能有效地?cái)U(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一周，無(wú)明顯活性改變。
適用范圍：
用于DNA的高保真擴(kuò)增，如基因表達(dá)克隆、基因定點(diǎn)突變、細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（SNP）和平末端補(bǔ)平等。
注意事項(xiàng)：
高保真KOD對(duì)于dNTP純度要求很高，因此建議用本酶配套的超純dNTP mix。
KOD DNA Polymerase的使用說(shuō)明：
一、配制 PCR 反應(yīng)體系：(于冰上配制)
Component | 50 μl Reaction | 終濃度 |
Template DNA | as required | 10pg-0.5μg |
Forward Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM |
10× KOD Buffer | 5 μl | 1× |
SuperPure dNTP mix（10 mM） | 1 μ | 0.2 mM |
KOD DNA polymerase(5U/μl) | 0.25-0.5 μl( 1.25-2.5 U) | |
ddH2O | up to 50 μl |
參考模板用量（50 μl 反應(yīng)體系）：
質(zhì)粒：5-20 ng；細(xì)菌基因組：10-100 ng；人類基因組：50-100 ng；cDNA：1-2 μl 。
注意：用 ddH2O 補(bǔ)足反應(yīng)體系（體積）至 50 μl。實(shí)際操作中，首先要計(jì)算好需要補(bǔ)加ddH2O 的量以后，建議先加水，然后按上述順序添加其它成分，最后添加 KOD DNA Polymerase。充分混勻后，離心數(shù)秒使反應(yīng)混合物沉到管底，然后將反應(yīng)管置于 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增。
二、設(shè)置 PCR 循環(huán)條件：（請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整）
Step | Temperature | Time | Cycle Number |
Initial denaturation | 94℃ | 3 minutes | |
Denaturation | 94℃ | 20-30 seconds | 30-35 cycles |
Annealing | 50-60℃ | 20-30 seconds | |
Extension | 72℃ | 1-4kb / minute | |
Final Extension | 72℃ | 5 minutes | |
4-8℃ | Hold |
注意：一般情況下，Annealing Temperature = Tm - 5°C
如果擴(kuò)增片段小于 4 kb，建議 KOD 酶的延伸速度為 1kb / 15 sec；
如果擴(kuò)增片段大于 4 kb，建議延伸速度為 1kb / 20-30 sec。
三、結(jié)果檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后取 5 µl 反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
KOD DNA Polymerase(含超純dNTP) PCR相關(guān)
